共产党在陕北定居后，一直成为蒋介石的心腹大患，于是，蒋介石利用共产党军队未站稳之际，决心消灭之。
张学良于1935年９月被蒋介石任命为“西北剿匪副总司令代理总司令”职务。这时，国际形势有了变化，共产国际召开第七次代表大会，确定了建立反法西斯统一战线的新策略。中共驻共产国际代表团以中华苏维埃中央政府和中共中央的名义发表了《为抗日救国告全体同胞书》，号召全中国人民团结起来，停止内战，一致抗日，组织国防政府和抗日联军。
毛泽东根据国际国内的形势的变化，把国内战争与民族战争相联系，提出一切战争都在民族战争的口号下进行。毛泽东非常尖锐地批判了党内的关门主义倾向，他指出：关门主义的策略则是孤家寡人的策略。关门主义“为渊驱鱼，为丛驱雀”，把“千千万万”和“浩浩荡荡”都赶到敌人那一边去，只博得敌人的喝彩。
为了促进抗日民族统一战线的早日建立，中共中央和毛泽东采取了一系列措施。毛泽东充分发挥他的聪明才智，运筹帷幄，他单独或与别人联合给国民党元老、地方实力派首领和爱国主义人士写信，阐述中共抗日民族统一战线政策，呼吁全国停止内战，一致抗日。
从“反蒋抗日”到“逼蒋抗日”，在这段时间里，毛泽东表现出娴熟的斗争艺术。一方面，坚持原则的坚定性，在停止内战一致抗日的问题上丝毫不让步；另一方面，在坚持原则的基础上又充分表现出灵活性，即为了停止内战一致抗日，我们可以作出重大让步，可以变斗争的对象为可以争取的同盟者。
1936年10月，蒋介石调兵遣将，部署兵力，把嫡系精锐部队约20个师摆在平汉线的郑州至汉口段和陇海线的郑州至灵皇段，集结待命，并扩大西安、兰州两地机场，调集200架新式战斗机和轰炸机备用，蒋介石表示共匪不剿完决不抗日。
1936年12月7日，蒋介石飞抵西安，此行目的是坐镇指挥12月12日开始的第六次“剿匪”行动。然而，蒋介石后院起火。张学良、杨虎城发动了震惊中外的“西安事变”。蒋介石被捉，逼其抗日。蒋介石的如意计划付诸东流。
事变传到延安，中共自然欣喜若狂。然在放蒋和杀蒋上争论十分激烈，毛泽东作为多数派的领袖，希望严厉处置蒋介石。毛泽东提出在政治上维护张、杨，以西安为中心来领导全国，控制南京。毛泽东还提出“要求罢免蒋介石，交人民公审”，认为“把蒋除掉，无论在哪方面，都有好处”。他强调为了争取群众，我们不轻易地发宣言，我们不是正面反蒋，而是具体地指出蒋的错误，不把反蒋与抗日对立，应更明确地举起抗日援绥的旗帜。在西安建立不要政府的名义但实际上是政府性质的机构。
延安召开了一次规模空前的大会。毛泽东在大会上发了言，在一片欢呼声中，大会通过了一项决议：蒋介石作为卖国贼应受群众审判。毛泽东作了一个赶毛驴上山的生动比喻，毛泽东说：“陕北毛驴很多，陕北老乡让毛驴上山有三个办法：一拉、二推、三打。蒋介石是不愿意抗战的，我们就采取对付毛驴一样的办法，拉他、推他、再不干就打他。当然喽，要拉得紧，推得有力，打得得当，驴子就被赶上山了，蒋介石也就抗日了。”
与此同时，莫斯科也很快得知了“西安事变”。出于自身利益，苏联《真理报》谴责了张学良的所做所为，并把西安事变说成是日本人的阴谋。斯大林则给毛泽东发去了一份电报，向中国共产党提出最后通牒：要么利用他们对张学良的影响，促成反蒋；要么他们在世界面前遭莫斯科的谴责，并断绝关系。据说，毛泽东看到了这份电报后，大发雷霆，跺脚不止。
最后，中共发表了《对西安事变通电》，将召开“抗日救国会议”改为“和平会议”。承认南京政府在全国的领导地位。同日，又发出《关于西安事变及我们任务的指示》，明确提出了和平解决西安事变的四项方针。西安事变的发生及其和平解决，结束了十年内战。
毛泽东在政治斗争、军事斗争中自觉地运用马克思主义宇宙观观察问题。早在1930年5月，毛泽东写的《反对本本主义》一文专门批评当时党内和红军中的教条主义，后又写了《实践论》与《矛盾论》。毛泽东关于矛盾问题的概括，是他对党内两条路线斗争，特别是对王明教条主义斗争的深刻总结。
就在毛泽东有发言权的时候，他们夫妻之间发生了裂痕。贺子珍毅然决然地向毛泽东提出离婚，而且于1937年10月离开延安，只身来到西安，然后去了苏联。
1937年8月22日，在陕北洛川召开政治局扩大会议，由毛泽东做关于军事问题和国共两党关系问题的报告，又通过《关于目前形势和党的任务的决定》、《抗日救国十大纲领》和毛泽东起草的宣传鼓动提纲《为动员一切力量争取抗战胜利而斗争》。
为建立抗日统一战线，共产党同意中止实行强制剥夺地主土地的政策。放弃以武力推翻国民党政府的目标，并将红军置于国民政府军事委员会的控制之下。为此，红军改编为国民革命军第八路军，下辖三个师：一一五师，师长林彪；一二Ｏ师，师长贺龙；一二九师，师长刘伯承。总兵力4.5万人，朱德任总指挥，彭德怀任副总指挥，但是，番号改成师后，共产党既没有削减军队的规模，也没有将军队的人数限制在标准的4.5万人之内，实际上，每个师后来都逐渐发展成一支强大的野战军。
南京政府及其军事委员会并没能掌握这支军队的实际控制权。在改编八路军的谈判过程中，蒋介石曾想派人到八路军担任有关职务，都被毛泽东顶回去。毛泽东始终坚持不允许任何人染指八路军，绝对保证中共对人民武装的领导权。1937年８月，中共政治局在洛川举行会议，会议决定，中共依然要控制住自己的军队，制定自己的战略方针，独立作战。
毛泽东主张八路军的独立自主的山地游击战。“洛川会议”后，八路军三个师以一一五师、一二Ｏ师、一二九师的顺序先后开赴山西前线作战。
第二战区司令长官阎锡山由于形势所迫，拟集中14个团在平型关以北与敌决战，希望八路军也能参战。经过商谈，一一五师参加平型关围歼日军的作战计划。毛泽东致电林彪：“我军应坚持既定方针，用游击战斗配合友军作战。”林回电陈述：“目前军民正在看我军直接参战，如我军参加兵力过少，则有失众望，目前以打仗、捉俘虏来提高军民抗战信心，提高党与红军威信。”由林彪指挥的平型关战斗，消灭日军1000余人，八路军伤亡600多人。全国反响热烈。
为使独立自主的山地游击战方针能够全面贯彻，毛泽东致电八路军总部：“不管蒋、阎协助与否，目前红军不宜过早暴露，要暂时把我军兵力一概隐蔽，并养精蓄锐，伺机在敌之实处侧后，举行广泛的袭击战。要告诉全党，今后没有别的工作，唯一的就是游击战争。”同时提出八路军的战略方针应该是“独立自主的山地游击战”，“只宜作侧面战，不宜作正面战”。
1937年，同蒋介石达成共同抗日的协议之后，毛泽东的军队尽量避免同敌人的主力部队作战，而是集中力量在农民中间建立游击根据地。日本人帮了很大的忙。他们占领和焚烧了华东广大地区的村庄，他们教育了人民，激发了人民的政治觉悟。日本人创造了条件，使共产党领导的游击队能够迅速增加兵源，扩大领土。三十年后，当日本人来见毛泽东，向他谢罪的时候，毛泽东却感谢他们的帮助。他说，他那时倒是希望日本军队能打到西安，甚至重庆。如果他们这样做了，游击队的力量会壮大得更快。
毛泽东指示：我党要不断巩固和扩大抗日民族统一战线，用长期合作来支持长期战争，坚持统一战线中的独立自主原则，既统一，又独立。
太原失陷后，1937年11月12日，毛泽东在延安党的活动分子会议上作了《上海太原失陷以后抗日战争的形势和任务》的报告。毛泽东是极富诱惑力的，因为他情感热烈，表情丰富。他作报告时，能牢牢控制自己，又能够自然地“深入角色，表现出真实的感情色彩。”
1937年11月，王明带着共产国际“新政策”的使命从苏联来到延安。这是毛泽东与王明的第一次见面。王明提出：中国目前的中心问题是在国共合作的基础上建立全中国反日各党派的抗日大联合，进而建立全中国统一的国防政府和全中国统一的民主共和国，并建立包括全中国各种武装力量在内同时有统一指挥、统一纪律、统一供给、统一武装、统一军事计划的统一的国家军队。
毛泽东知道王明传达的是共产国际和斯大林的指示，他表示接受共产国际关于“共同负责，共同领导”的意见，并表示赞同王明关于在现有基础上帮助和改造国民党政府的看法。但不久，毛泽东便对王明所推行的右倾投降主义和目无中央的态度日益不满，双方的矛盾不断加剧和公开化。毛泽东采取了较好策略，一方面派王稼祥到苏联，告了王明一状，一方面开始清算王明右倾投降主义。在1938年9月召开的六中全会上，毛泽东作了《论新阶段》的政治报告和《统一战线中的独立自主问题》及《战争和战略问题》的总结报告。同时尖锐地批判了党内在统一战线问题上的关门主义和投降主义的偏向，着重批判了“一切经过统一战线，一切服从统一战线。”他分析了抗日时期统一战线的统一性与独立性，民族斗争与阶级斗争的关系。他说，用长期合作支持长期战争，阶级斗争必须服从抗日民族斗争，这是统一战线的根本原则。在原则下，保持党派和阶级的独立性，保持统一战线中的独立自主，不是因为合作和统一而牺牲党派和阶级的必要权利，而是相反，坚持党派和阶级的一定限度的权利，这才有利于合作，也才有所谓合作，否则，就是将合作变成混一，必然牺牲统一战线。他指出，国民党是当权的党，它统治民众运动，限制共产党的发展，剥夺各党派的平等权利，不愿制定共同的政治纲领，不允许有统一战线的组织形式。在这种情况下“一切经过统一战线”那就是一切经过蒋介石、阎锡山，成为单方面服从，自己束缚自己的手脚。在当前的形势下，我们应该根据不同的情况，分别采取“先奏后折”、“先斩后奏”、“斩而不奏”、“不斩不奏”等对策。
六中全会，使毛泽东赢得了斗争的主动权。会后，毛泽东谈笑风生问身边工作人员：我问你，你愿意不愿意去开一个牛皮公司，由你来当经理。开一个牛皮公司，要有很大的本领噢！第一，当牛皮公司的经理要厚脸皮；第二，当牛皮公司的经理，要会夸夸其谈，还要会阿谀奉承；第三，当牛皮公司的经理，还要会拉拢一帮人替他卖力；第四，当牛皮公司的经理，还要会作广告，会印小册子，扩大宣传；第五，……。毛泽东一边说一边扳着指头，哈哈大笑，他讲的牛皮公司实际上是指王明。毛泽东又一次取得党内斗争的胜利，地位日益巩固。
在华北联合大学成立大会上，毛泽东发表即席讲话，他用古典小说《封神榜》里的一个故事作比喻说：当年姜子牙下昆仑山，元始天尊送他杏黄旗、方天印、打神鞭三样法宝，姜子牙用这三样法宝打败了所有的敌人。今天，你们也要下山了，要去前线跟日本侵略者作战，我也赠你们三个法宝，这就是：统一战线，游击战争和革命团结。
1939年10月，毛泽东在《（共产党人）发刊词》中，从正反两个方面系统地总结了中国共产党第一次大革命时期，土地革命战争时期以及抗日战争初期土地革命战争时期以及抗日战争初期如何进行新民主主义革命的丰富经验，提出“统一战线，武装斗争，党的建设”是中国共产党在中国革命中战胜敌人的三个法宝。”
平型关战斗后，共产党再也没有进行大规模的行动，直至1940年夏，彭德怀集合大约40万人，发动了一次以“百团大战”而著称的重大进攻。
就这样，在抗日战争的条件下，保持中共的独立性，放手发展人民的力量，发展中共的阵地，在不破裂统一战线的原则下，根据不同形势和情况，采取不同策略，冲破国民党限制来发展壮大人民力量，对蒋采取先奏后斩、先斩后奏、斩而不奏和不斩不奏的策略。总之是应付自如，游刃有余。
毛泽东提出，对国民党的军事进攻要敢于和善于进行坚决的武装斗争，“斗争是团结的手段，团结是斗争的目的，又斗争又团结，以斗争求团结”的总的指导方针。
针对当时流行的亡国论、速胜论思想，1938年5月，毛泽东写了《论持久战》。
1938年10月，抗日战争进入相持阶段，1939年1月，国民党召开五届五中全会，通过了溶共、防共、限共、反共的方针。国共磨擦加剧，到1939年底至1940年初，终于掀起第一次反共高潮。
毛泽东采取针锋相对的对策，第一次提出了“凡是敌人反对的，我们就要拥护；凡是敌人拥护的，我们就要反对”和“人不犯我，我不犯人；人若犯我，我必犯人”的政治原则。针对中共党内因激愤于国民党的反共分裂活动而滋生了“左”的情绪，毛泽东作了《目前统一战线中的策略问题》的报告，毛泽东指出，党的统一战线政策的根本原则，是又联合又斗争，以斗争求团结。在斗争过程中，必须遵循有理、有利、有节的原则。有理，即自卫原则，决不可无故进攻别人，也决不可在被人攻击时不予还击，对于国民党顽固派的军事进攻，必须坚决、彻底、干净、全部消灭之。有利，即胜利原则，与国民党顽固派斗争时，不斗则已，斗则必胜，决不可举行无计划无准备无胜利无把握的斗争。有节，即休战原则，在一个时期内把顽固派的进攻打退之后，在他们没有举行新的进攻之前，斗争应该适可而止，在双方休战时，我们应主动同国民党讲团结，决不可无休止地每时每刻斗下去，决不可被胜利冲昏自己的头脑。
毛泽东为抗日民族统一战线制定的策略总方针是：发展进步势力，争取中间势力，反对顽固势力。
发展进步势力，就是发展无产阶级、农民阶级和城市小资产阶级的力量，放手扩大八路军、新四军，广泛创立抗日民族根据地，广泛发展共产党组织，充分发展民众运动，争取广大的知识分子。毛泽东为此向全党发出号召，要努力发展自己的力量，把八路军、新四军发展成抗日的主力，把中国共产党发展成有广泛群众基础的有全国影响的大党。1940年，中共领导的武装部队由抗战开始的5万多人发展到50万人，此外，还有大量的地方武装和民兵。除陕甘宁边区外，在华北、华中和华南建立了16块抗日根据地，共拥有近1亿人口。
争取中间势力，就是争取中等阶级、开明绅士和地方实力派。
孤立顽固势力，主要是孤立以蒋介石为代表的大地主大资产阶级。在思想上、政治上、军事上作坚决的斗争。毛泽东为中共制订了利用矛盾，争取多数、反对少数，各个击破的策略原则。
1939年，中国抗战出现了非常错综复杂的局面，中共八路军、新四军挺进华北，战斗在被国民党丢弃的广大国土上，放手发动群众，广泛开展游击战争，建立了大片的敌后抗日根据地。
在正面战线上，蒋介石料难与日相对抗，相反眼睁睁见中共势力范围在逐步扩大，蒋感到十分恼火。国民党指责中共统治的陕甘宁边区是封建割据，八路军、新四军游而不击。
自1939年以后，由于经济封锁，延安边区在经济上发生了很大困难。毛泽东向边区和根据地军民发出了“自己动手，丰衣足食”。毛泽东在一次生产动员大会上说：“饿死呢？解散呢？还是自己动手呢？饿死是没有一个赞成的，解散也是没有一个人赞成的，还是自己动手吧——这就是我们的回答。”
这时，党外人士李鼎铭提出“精兵简政”方案，毛泽东觉得这办法很好，说：“这恰恰是改造我们的机关主义、官僚主义、形式主义的对症良药。”经过3次整编，政府机关裁并了1/4，工作人员减少了35％。
为粉碎国民党顽固派在政治思想上的进攻，打破民族资产阶级的幻想，毛泽东操起了理论武器，这是毛泽东驾轻就熟的武器。1939年6月，毛泽东又写了《反投降纲领》。
毛泽东在战争中，常忙里偷闲，经常打麻将。他能从麻将的排列组合中找出辩证关系，再进而向众人讲述马列主义的辩证法。忽而把麻将同美元贬值题联系起来，忽而又把麻将同宣传、组织群众结合起来。一次，他竟然把麻将同反对封建迷信连了起来，他说麻将和神一样，都是人做的。目的都是用，不过用处不同的人打麻将是为消遣和娱乐，而创造神则是为了表达征服自然，主宰世界的愿望。人们创造的龙王就是为了让它上天行好事，四方呈吉祥。
1940年1月，毛泽东集中精力，写出指导革命斗争的《新民主主义论》。
在抗日战争初期，国共之间保持着一种理智的合作关系。共产党信守了诺言，中断了激进的土地政策，代之以减租减息，蒋介石也信守诺言，允许共产党人在他的首府设立办事处，并出版日报。
然而，随着政府控制区的减少，共产党控制区的扩大，国共两党的这种合作关系日益紧张起来。1939年后，国民政府极力想阻止共产党向南、向西发展。
早在1938年５月，毛泽东曾致电项英，指出在敌后进行游击战争，比在敌前同友军一道受其指挥更好。要他放手到苏南、皖南敌后广大地区发展。之后，又指示说：利用目前有利时机，主动的、积极的深入到敌人后方去。1939年冬，新四军总兵力已近３万人。
从1939年开始，国共两党的摩擦纠纷，在各地不断发生，乃至有些地区发生武装冲突。是年３月，国民党颁发了《防止异党活动办法》决定。决定指出：“共党活动最烈区域应实行联传连坐法。”密令各地执行。七月，抗战两周年纪念日上，中共发表宣言，提出：妥协与分裂是当前两个最大的危险。号召全国人民起来，坚持抗战、团结、进步，反对投降、分裂、倒退。到10月，国民党又秘密颁布《共党问题处置办法》。12月，胡宗南部又进驻陕甘宁边区的五个县，更加剧了两党关系的恶化形势。
1940年，各地磨擦更多，纠纷益甚，苏北韩德勤部和新四军发生激烈冲突。10月，两党关系严重恶化。核心问题是军事问题。国民党指斥中共：一不守战区范围，自由行动；二不遵编制数量，自由扩充；三不服从中央命令，破坏行政系统；四不打敌人，专事吞并友军。
1941年1月4日，叶挺、项英率部九千余人，分三路由驻地云岭地区往南进入茂林地区。这时，国民党52师、40师、108师、79师、144师、62师以及新７师，形成包围圈。1月6日发生激烈战斗。最后，新四军伤亡2000余人，被捕俘4500余人，仅千余人突围；军长叶挺被俘，副军长项英身亡，这就是著名的“皖南事变”。
1月17日，蒋介石发布命令，宣布新四军为叛军，取消新四军番号。中共采取针锋相对的斗争，重新组建新的新四军军部，陈毅为代军长，刘少奇为政委。这实际上就宣告国共合作关系的终结。
皖南事变的消息传到延安后，毛泽东大怒，提出只有猛烈的坚决的反攻，方能打退蒋介石的挑畔与进攻。并决定立即结束政治上的温和态度，发动政治上的全面反攻，在军事上准备一切必要力量粉碎其进攻。然而，共产国际出于自身原因，要求中国共产党严格注意把握党的政策，不可主动破裂国共关系，不可另起炉灶，而应将斗争矛头指向亲日派。毛泽东为此恼怒不已。
3月18日，毛泽东为中共中央起草了党内指示《打退第二次反共高潮后的时局》。到抗战后期，国内外形势发生了重大变化，国民党损失兵力40多万，而八路军和新四军却发展到50多万，民兵增加到220万，共产党已在敌占区开辟了19个大大小小的根据地，解放区人口增加到9000万。
